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細胞複蘇、細胞凍存和(hé)細胞超低(dī)溫冰箱存儲實驗室方法實驗步驟分享

時(shí)間(jiān):2015-05-14 10:20 來(lái)源:未知

最近一直在做(zuò)細胞實驗，逛論壇發現很(hěn)多(duō)人(rén)在細胞實驗中常遇到：細胞凍存後很(hěn)難複蘇，或者複蘇後出現大(dà)量死亡細胞。細胞的狀态直接影(yǐng)響後續的實驗，以下從細胞複蘇、細胞凍存和(hé)細胞超低(dī)溫冰箱存儲，三個(gè)方面分享我們實驗室的方法，不敢說權威，但(dàn)真的總結了自己多(duō)年來(lái)的一些(xiē)經驗教訓，供大(dà)家(jiā)參考：

細胞複蘇

1）75％酒精擦拭超淨工作(zuò)台，放置已消毒的培養瓶、吸管等，紫外線照射20min；

2）冰箱中取出凍存管并迅速放入已預熱的37℃水(shuǐ)浴鍋中，不斷搖動，使凍存管迅速融化（快溶過程）；
3）将凍存液移至加入4mL細胞培養液的離心管中；
4）将細胞懸浮液1000rpm離心5min；
5）吸取上(shàng)清液，用1mL培養液重懸細胞；
6）在細胞培養瓶中加入4mL培養基，然後将1mL細胞懸液接種至培養瓶中，輕輕混勻，将培養瓶放入CO2培養箱中培養；
7）24h小(xiǎo)時(shí)內(nèi)更換一次培養液，繼續培養。

細胞凍存

1）75％酒精擦拭超淨工作(zuò)台，放置已消毒的培養瓶、吸管等，紫外線照射20min；
2）去除舊(jiù)培養液，用PBS沖洗2次，細胞培養瓶中加入600µL胰蛋白酶，顯微鏡下觀察細胞，若細胞回縮、細胞間(jiān)隙擴大(dà)、細胞開(kāi)始變圓，輕輕拍打細胞培養瓶，加入5mL培養液終止消化；
3）将細胞懸浮液轉移至離心管中，1000rpm離心5min；
4）離心後的細胞，棄上(shàng)清加入1.5mL預冷的細胞凍存液，混合均勻後移入凍存管中，放入細胞程序降溫盒（慢凍過程），短(duǎn)期使用的細胞可(kě)保存于-80℃冰箱中。

細胞超低(dī)溫冰箱存儲

　　通(tōng)過上(shàng)面辛苦操作(zuò)得(de)到的細胞，在存儲上(shàng)一定得(de)小(xiǎo)心，吐槽下我們實驗室經曆過的慘痛教訓：
存儲空(kōng)間(jiān)劃分與管理(lǐ)

以前問題

　　因為(wèi)實驗室人(rén)比較多(duō)，冰箱每個(gè)人(rén)存儲空(kōng)間(jiān)劃分不合理(lǐ)（長期被師(shī)兄師(shī)姐占領大(dà)部分空(kōng)間(jiān)，無力吐槽啊），大(dà)家(jiā)樣品都亂存亂放（劃分不合理(lǐ)，其他人(rén)隻能見縫插針了）。冰箱門(mén)反複開(kāi)關，樣品找尋時(shí)間(jiān)過長，直接導緻冰箱漏冷，且因為(wèi)溫度不均造成細胞反複凍融，大(dà)大(dà)降低(dī)了細胞質量。

解決辦法

　　1）建立相關流程及管理(lǐ)規則（根據大(dà)家(jiā)的存儲量，合理(lǐ)劃分；定期進行(xíng)冰箱樣品清理(lǐ)，保證空(kōng)間(jiān)合理(lǐ)利用；老闆牽頭引起大(dà)家(jiā)重視(shì)；建立懲罰措施，确保嚴格遵守）

　　2）若實驗要換置冰箱，建議購買一個(gè)智能些(xiē)的

　　我們實驗室培養了幾十株細胞，實驗組五人(rén)存放凍存細胞時(shí)，選擇查詢“***細胞”，所有(yǒu)的存取位置一目了然，再打開(kāi)冰箱門(mén)，直接找到位置進行(xíng)取放，一步到位很(hěn)方便。

　　細胞複蘇、凍存及存儲操作(zuò)一直都是細胞實驗中最基礎的工作(zuò)，很(hěn)多(duō)時(shí)候後續實驗出現問題，很(hěn)大(dà)一部分原因都是因為(wèi)這些(xiē)基礎工作(zuò)做(zuò)的不到位，根據自己實驗室條件，合理(lǐ)優化上(shàng)述步驟與方法，相信你(nǐ)的細胞實驗未來(lái)能更加順利。

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